A confirmação laboratorial de um caso de TB envolve a correlação de resultados de diversos métodos laboratoriais, que devem ser corretamente utilizados sendo norteados pelas suas indicações de uso.
O diagnóstico inicial de casos novos deve ser realizado preferencialmente pelo TRM-TB, e, quando não disponível, a baciloscopia deve ser o método de escolha, complementada pela cultura, conforme a recomendação do Ministério da Saúde.
Cabe enfatizar a necessidade da correta orientação à pessoa com suspeita de TB sobre a coleta do material, a quantidade e forma de armazenamento até a chegada ao laboratório. A solicitação deve ter os dados completos requeridos para orientar a equipe do laboratório e o preenchimento correto dos sistemas de informação.
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Baciloscopia
A baciloscopia, metodologia amplamente empregada no diagnóstico laboratorial da tuberculose, consiste na pesquisa do bacilo por microscopia ótica em um esfregaço de amostra clínica corado com metodologia específica. Apesar de ser bastante utilizada, a metodologia apresenta uma baixa sensibilidade, sendo necessários 5 a 10 mil bacilos por mililitro de amostra para que o respostado seja positivo (BRASIL, 2022).
O protocolo de baciloscopia mais amplamente utilizado no país consiste, resumidamente, na preparação do esfregaço: a amostra clínica é colocada em uma lâmina de vidro e depois fixada por calor, com a utilização do bico de Bunsen. Após a fixação, o material é corado pelo método de Ziehl-Neelsen, que consiste na coloração da amostra com fucsina fenicada, seguida de lavagem com água, de descoloração com álcool-ácido e posterior coloração de fundo utilizando azul dde metileno. A alta concentração de ácidos micólicos na parede celular do bacilo faz com que eles sejam corados por esse método e se tornem visíveis, apresentando uma coloração avermelhada que pode ser vista por intermédio da microscopia ótica com uma ampliação total de 1.000 vezes (enquanto o campo de fundo e eventuais contaminantes aparecem corados de azul, conforme mostra a Figura 2).
Depois da leitura da lâmina, é possível classificar a amostra como:
Atenção!
Vale ressaltar que essa metodologia visa observar o bacilo em microscopia, não sendo possível avaliar a viabilidade e o padrão de resistência do bacilo a antibióticos.
A baciloscopia está indicada para a investigação diagnóstica de tuberculose em casos novos, quando não disponível o TRM-TB, em casos com tratamento prévio e para o controle bacteriológico durante o tratamento.
Cultura
A cultura é um exame laboratorial que visa isolar os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) para posterior cultivo em meio específico. Ao contrário da baciloscopia, ela permite avaliar a viabilidade dos bacilos presentes na amostra clínica, sendo um importante indicador do sucesso do tratamento do paciente. É um método mais sensível que a baciloscopia (limite de detecção de 10 a 100 bacilos por mililitro de amostra), além de permitir a realização de outras metodologias em caso de resultado positivo, como os testes de sensibilidade e sequenciamento genético.
Para a realização da cultura, é necessário que o material seja previamente submetido a uma etapa de fluidificação e descontaminação.
A descontaminação é de extrema importância, pois, caso as micobactérias sejam colocadas em meio de cultura na presença de outro micro-organismo viável, ele tenderia a crescer mais rápido e a esgotar os nutrientes do meio, o que impediria a multiplicação das micobactérias. Dentre os principais agentes fluidificantes-descontaminantes utilizados estão o hidróxido de sódio, N-acetil-L-cisteína (NALC) e o ácido oxálico (BRASIL, 2022).
O material tratado é então semeado em meio de cultura com composição e condições específicas que favorecem o crescimento das micobactérias.
Os meios utilizados podem ser classificados, em função de seu estado físico, em líquidos (Middlebrook 7H9 e Middlebrook 7H9 modificado) e sólidos (Löwenstein-Jensen, Ogawa-Kudoh, Middlebrook 7H10 e Middlebrook 7H11) (BRASIL, 2022).
Enquanto a utilização do meio líquido propicia o crescimento mais acelerado das micobactérias, o cultivo em meio sólido permite, por meio da análise macroscópica da cultura, fazer uma análise prévia para a identificação da espécie da micobactéria presente no material (Figura 3).
A realização da cultura é indicada quando:
As metodologias fenotípicas para avaliação da resistência a antibióticos, também conhecidas como teste de sensibilidade, têm como finalidade avaliar a capacidade de um isolado bacteriano (proveniente de uma cultura positiva) crescer ou não em um meio contendo antibiótico.
De uma maneira geral, na prática, os isolados bacterianos são colocados em meios de cultura contendo determinado antibiótico e em meio sem antibióticos, este último funcionando como controle da viabilidade da bactéria. Caso haja o crescimento no meio com antibiótico, dizemos que a bactéria é “resistente”; caso contrário, dizemos que ela é “sensível”.
A realização do teste de sensibilidade é indicada quando:
Entre as principais metodologias utilizadas hoje em dia para avaliação fenotípica da resistência aos antibióticos encontram-se os métodos que serão apresentados a seguir.
O método das proporções tem como objetivo detectar a proporção de bactérias resistentes dentro de uma população de M. tuberculosis usando uma concentração específica e padronizada de um determinado antibiótico (concentração crítica). Como é esperado que dentro de uma população bacteriana exista naturalmente bactérias resistentes, se a proporção observada for maior do que a proporção de referência (proporção crítica) dizemos que a amostra é resistente. Caso seja menor, ela será considerada sensível ao antibiótico testado.
Em relação à execução da técnica, o método das proporções é realizado em meio de cultura sólido. O teste pode ser classificado como direto (quando realizado diretamente do material clínico) ou indireto (quando realizado a partir de uma cultura positiva).
O teste indireto, apesar de mais demorado, é mais vantajoso por:
O tempo de leitura padronizado para o método das proporções é de 28 dias (caso haja colônias suficientes para leitura e resultado conclusivo) ou 42 dias.
O BACTEC MGIT 960 é um sistema automatizado para detecção de crescimento de micobactérias e teste de sensibilidade a drogas para o M. tuberculosis. O MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) utiliza um tubo específico com meio líquido (Middlebrook 7H9), o que favorece o crescimento das micobactérias.
O teste realizado pelo sistema BACTEC MGIT 960 baseia-se no princípio da relação entre o consumo de oxigênio e a quantidade de bactérias.
O tubo de MGIT tem um anel de silicone contendo um sensor fluorescente cuja emissão de luz é inibida em presença de oxigênio (Figura 4). Ao adicionar micobactérias ao tubo, o crescimento bacteriano acarretará o consumo de oxigênio, o que resultará na emissão proporcional de fluorescência, detectada pelo aparelho a cada 60 minutos. A unidade de crescimento bacteriano nesse sistema é denominada de GU (Growth Unit/Unidade de crescimento) (BRASIL, 2022).
Atenção!
O modo de avaliação do sistema por meio do consumo de oxigênio pode ter algumas implicações relevantes. A utilização de amostra sanguínea não é recomendada em virtude da possibilidade de se ter um resultado falso-positivo. Da mesma forma, os antibióticos utilizados no sistema têm que ser avaliados quanto à possibilidade de oxidação, o que acarretaria um resultado falso-positivo.
Quando se utiliza o sistema para realização de teste de sensibilidade, o equipamento interpreta o resultado quando a GU no tubo sem antibiótico (tubo controle) atinge o valor de 400 (geralmente entre 4 e 13 dias). O aparelho então interpreta os resultados dos tubos correspondentes à amostra com antibióticos em “sensíveis” (quando o valor da GU do tubo for inferior a 100) e “resistentes” (quando o valor da GU do tubo for igual ou superior a 100).
Um dos principais motivos para a demora na liberação do resultado de diagnóstico laboratorial da tuberculose é o tempo de geração (tempo necessário para uma célula se dividir em duas), que no caso da M. tuberculosis é de 18 a 24 horas.
Como alternativa para acelerar o diagnóstico, diversas abordagens, usando métodos moleculares, vêm sendo desenvolvidas. A lógica de se utilizar essas ferramentas se baseia na avaliação, por exemplo, da resistência a antibióticos usando como base a presença ou não de mutações em regiões específicas do genoma (Figura 5). Para isso, o material genético (DNA) é extraído e amplificado por PCR (reação em cadeia da polimerase).
Ao compararmos o tempo de uma abordagem fenotípica (dependente do crescimento bacteriano) com a abordagem genotípica (dependente da realização de PCR), é possível notar que este último consegue duplicar o material em cerca de dois minutos, tempo consideravelmente menor que o necessário para a geração de novas bactérias.
Apesar de promissoras, as metodologias baseadas em análises moleculares para avaliação da resistência apresentam algumas desvantagens. Uma delas está na correlação não exata entre a presença de mutação no DNA e a resistência a antibióticos. Várias são as causas que podem explicar essa situação, como o fato de o código genético (relação entre a sequência de códons presente no DNA e a sequência de aminoácidos presente na proteína) ser degenerado. Tal característica ocorre pelo fato de existir 64 códons possíveis, mas apenas vinte aminoácidos, fazendo com que mais de um códon possa definir o mesmo aminoácido. Sendo assim, existe a possibilidade de uma determinada mutação no DNA não alterar o aminoácido a ser inserido, não mudando a proteína e consequentemente não interferindo na fisiologia da bactéria.
Caso uma mutação não altere o aminoácido a ser inserido, ela é classificada como silenciosa. Tal discordância existe entre os métodos moleculares comerciais disponíveis, mas tende a diminuir com o sequenciamento genômico em larga escala.
Ao longo dos anos, os métodos genotípicos vão sendo aprimorados, e hoje já há uma série de mutações genéticas identificadas que têm correlação confirmada com a resistência fenotípica. O principal exemplo é a identificação de mutação no gene rpoB, considerado atualmente o padrão ouro para o diagnóstico de resistência à rifampicina.
Outra possível causa para explicar a não perfeita correlação entre os dados moleculares e fenotípicos é o fato de algumas das metodologias disponíveis analisarem apenas uma pequena região do DNA. Isso faz com que uma importante mutação possa não ser detectada, caso ela esteja fora da região analisada, indicando um resultado falso negativo.
A seguir estão os métodos moleculares mais utilizados disponíveis para avaliação da resistência molecular a antibióticos:
Teste Rápido Molecular para Tuberculose (TRM-TB)
Um dos primeiros testes moleculares utilizados amplamente e que também avaliam a resistência a antibióticos foi o Xpert MTB/RIF, do sistema GeneXpert, produzido pela empresa Cepheid, e que no Brasil ganhou a nomenclatura TRM-TB.
O teste Xpert MTB/RIF permitia, a partir de uma amostra clínica e sem a estrutura de um labsoratório de biologia molecular, realizar a extração e amplificação do DNA por meio de PCR em tempo real (qPCR) e avaliar a presença ou não do complexo M. tuberculosis, bem como inferir a resistência à rifampicina (Figura 6). Todo o processo ocorria em uma única máquina, sem muita intervenção por parte do operador, e levava aproximadamente uma hora e meia, um tempo bem inferior ao necessário para determinação da sensibilidade por métodos fenotípicos (BRASIL, 2022).
A principal desvantagem desse teste era que analisava apenas a região do DNA de M. tuberculosis com maior incidência de mutações relacionadas à resistência à rifampicina, também conhecida como região hotspot. No caso específico da rifampicina, a região hotspot analisada correspondia a um trecho de 81 nucleotídeos do gene rpoB. Sendo assim, mutações fora dessa região acarretavam resultados discordantes quando comparados com os resultados de teste de sensibilidade. Outra desvantagem está na quantidade de material clínico necessária para a realização do teste (cerca de 1 mililitro), o que pode inviabilizar a sua realização em algumas amostras.
Posteriormente, foi lançado um novo cartucho para a tuberculose, o Xpert MTB/Rif Ultra, usando o mesmo sistema, mas com uma melhora em relação à sensibilidade na detecção do bacilo, sem modificação da sensibilidade de detecção da resistência. Com o lançamento, o fabricante do cartucho descontinuou a versão anterior.
Mais recentemente, um novo cartucho foi lançado para o mesmo sistema: o Xpert MTB/XDR. Ele tem como principal diferença a capacidade de avaliar a resistência à isoniazida, às fluoroquinolonas, às drogas de segunda linha injetáveis (amicacina) e à etionamida. Apesar da vantagem desse teste em avaliar outros antibióticos, que não eram analisados nos outros cartuchos, ele tem uma desvantagem específica, que é a necessidade de se fazer um “upgrade” no equipamento para que o cartucho possa ser utilizado, com troca ou aquisição de novo componente. Tal mudança é necessária porque o sistema anterior era equipado com um leitor de seis cores capaz de ler o cartucho Xpert MTB/Rif Ultra, mas que não lê o novo cartucho Xpert MTB/XDR, que necessita de um módulo com leitor de 10 cores (CEPHEID, [2022]).
Testes comerciais de sonda em linha
Em 2021, outro teste molecular com capacidade de avaliar a resistência a antibióticos utilizados no tratamento da tuberculose foi incorporado ao SUS: os testes comerciais de sonda em linha (LPA, Line in probe assay). Os testes incorporados fabricados pela empresa Hain Lifescience compreendem o Genotype MTBDRplus (capaz de detectar mutações relacionadas à resistência à rifampicina e à isoniazida) e o Genotype MTBDRsl (capaz de detectar mutações relacionadas à resistência às fluoroquinolonas e aos aminoglicosídeos).
A execução desses testes pode ser feita tanto a partir do material clínico quanto de uma cultura positiva. Caso seja feita a partir da cultura, o tempo de liberação do resultado final será consideravelmente aumentado.
De uma maneira geral, o teste tem como etapas a extração do DNA (do material clínico ou da cultura), amplificação por PCR e hibridização reversa em uma fita contendo, por exemplo, regiões do DNA relacionadas com a resistência a antibióticos, bem como controles positivos da reação do PCR e controles negativos.
A fita é lida usando como base as marcações relativas às regiões selvagens (sem mutação) e às regiões mutadas. Caso o sinal apareça apenas na posição selvagem da região gênica analisada, diz-se que a amostra é “sensível” ao antibiótico relacionado. Mas se aparecer na posição mutada da região gênica analisada (podendo ou não ser acompanhada do desaparecimento do sinal da posição selvagem), diz-se que a amostra é “resistente” ao antibiótico relacionado (Figura 7).
Em ambas as fitas, há controles positivos relacionados à revelação do resultado (posição 1; controle do conjugado); à etapa do PCR (posição 2; controle de amplificação); e controle da amplificação específica para o complexo MTB (posição 3; complexo M. tuberculosis). Além dessas posições, cada teste terá posições para regiões do DNA relacionadas com a resistência a antibióticos específicos, tanto com posições específicas para a sequência selvagem (sem mutação) como para sequências contendo as principais mutações encontradas para aquela região.
A seguir, veja algumas vantagens e desvantagens dos testes comerciais de sonda em linha:
Capacidade de se avaliar a resistência a múltiplos genes.
Uma vez extraído o DNA, ele pode ser utilizado em qualquer um dos testes (Genotype MTBDRplus e Genotype MTBDRsl).
Necessidade de uma infraestrutura apropriada, em relação ao sistema GeneXpert, com salas separadas para etapas de pré-amplificação e pós-amplificação.
Equipamentos para a realização da técnica (por exemplo, máquina de PCR e micropipetas), que podem encarecer a implementação.
Necessidade de pessoal qualificado para a realização de ensaios de biologia molecular.
Sequenciamento genético
O sequenciamento de regiões do DNA é uma técnica possível de ser utilizada, entre outras, como abordagem molecular para detecção de resistência a antibióticos. De uma maneira geral, a técnica consiste em identificar a sequência de nucleotídeos (parcial ou total) em uma amostra de DNA, analisando-a com base em banco de dados disponíveis (GenBank, por exemplo). Por identificar a sequência nucleotídica, o sequenciamento é considerado padrão ouro em relação às outras técnicas moleculares.
O sequenciamento tradicional utilizando a metodologia de Sanger é capaz de sequenciar apenas pequenos trechos de DNA de cerca de centenas de nucleotídeos, suficiente para sequenciar trechos de alguns genes, mas insuficiente para sequenciar o genoma de M. tuberculosis inteiro, por exemplo. Etapas adicionais podem ser utilizadas, mas o tempo e o custo necessários inviabilizam o seu uso na rotina de diagnóstico.
Em contrapartida ao sequenciamento tradicional, o NGS (sequenciamento de nova geração) é uma nova estratégia que vem sendo desenvolvida com o objetivo de sequenciar o genoma inteiro com um custo e tempo mais reduzidos. Em função da grande quantidade de dados gerados, faz-se necessária uma robusta etapa pós-analítica, com intuito, por exemplo, de montar as sequências geradas, assim como correlacionar os dados obtidos com dados disponíveis em banco de dados.
Recentemente, a OMS publicou um catálogo com mutações descritas no complexo MTB e sua associação com a resistência a antibióticos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2021). Essa publicação foi possível em grande parte pelo sequenciamento total do genoma – Whole Genome Sequencing (WGS) – dos isolados clínicos, em paralelo com os dados de teste de sensibilidade a drogas. Esforços nesse sentido podem acelerar a geração de conhecimento sobre as mutações e sua relação com a resistência, baseados em biologia molecular.
